亳白芷挥发油成分的气相色谱质谱联用分析_药学论文
亳白芷挥发油成分的气相色谱质谱联用分析_药学论文
【医药论文】导语，我们所欣赏的此篇共有47786文字，由孔佩锡细致改正之后，发布到作文站()。药材即可供制药的原材料，在中国尤指是中药材，即未经加工或未制成成品的中药原料。中药是中国传统的药材，中国药文化源远流长、博大精深，既包含数千年中药文明又融合近现代西药文明所创造的中西药并举、独具特色的文化现象，是中国优秀文化的重要组成部分。亳白芷挥发油成分的气相色谱质谱联用分析_药学论文如果你对此篇文章有什么独特的建议，请告诉我们！
第一篇 亳白芷挥发油成分的气相色谱质谱联用分析_药学论文
作者：马逾英，王娜，张利，车早红
【摘要】 目的研究亳白芷的挥发油化学成分。方法采用气相色谱-质谱联用技术亳白芷药材挥发油种类和含量，并与同样方法处理过的川白芷进行比较。结果从亳白芷中鉴定出37种成分。结论亳白芷含有大量的碳烯、醇、酸、酯类物质。
【关键词】 亳白芷； 挥发油； 气相色谱-质谱联用
abstract:objectiveto explore the chemical components of the essential oil of angelica dahurica from bozhou. methodsthe essential oil from angelica dahurica was separated and ysed by gc -ms,and compared with angelica dahurica from sichuan.results37 compounds were separated and identified.conclusionterpenes and their oxoderivatives are the major chemical constituents in the essential oil,including alkenes，alcohol ，acid，cyclododecane and ester.
key words:angelica dahurica from bozhou; essential oil; gc-ms
白芷为伞形科植物白芷angelica dahurica (fisch. ex hoffm.) benth.et hook. f.或杭白芷angelica dahurica(fisch. exhoffm. )benth. ethook.f. var. formosana (boiss.) shan etyuan的干燥根［1］。wwW.近些年，除传统的四大产区外，对安徽亳州种植白芷曾有多次报道，且产量较大，已形成一定规模。目前，对亳白芷挥发油成分的研究未见报道。本实验采用气-质联用法首次对亳白芷药材进行了挥发油成分的研究，并与川产白芷药材挥发油做了对比。
1 材料与方法
1.1 药材来源见表1。表1 药材来源（略）
以上对口药材均经作者鉴定。
1.2 挥发油的提取及制备称取白芷药材粗粉100 g，加乙醚200 ml超声处理1 h，减压回收溶液得浸膏，浸膏内加蒸馏水300 ml，照挥发油测定法［1］保持微沸12 h，得挥发油，用乙酸乙酯定容至1 ml，备用。
1.3 仪器与测试条件hp6890/5973gc-ms联用仪(美国hewlett-packark公司)。gc条件：色谱柱hp1-ms毛细管柱（50 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯he气，程序升温从柱温100℃，以14℃/min程序升温到170℃，以2℃/min程序升温到190℃，以5℃/min程序升温到230℃，再以40℃/min程序升温到310℃，进样口温度为260℃，进样量1 μl（15∶1）；ms条件：ei离子源,电子能量70 ev，离子源温度280℃，扫描范围(m/z): 30～500。
2 结果
对2种白芷挥发油进行了gc-ms，经过气质谱联仪给出的质谱数据和计算机检索出的可能结构，并查阅有关的文献资料与标准品的质谱图进行比较，共鉴定出75个化合物。各种成分在挥发油中的相对含量由面积归一化法计算得到。结果见表2。表2 亳白芷及川白芷的gc-ms结果（略）
由表2可知，两种白芷样品挥发油的主成分是酸、酯及烷烃类,其次为碳烯、醇,约占整个挥发油的82%，其中亳白芷51种，主成分是9-十六碳烯酸十四烷酯（11.40%）、2-氯乙基亚油酸（10.69%）、9,12-十八二烯酸乙酯（7.28%）、环十二烷（8.23%）；川白芷的主成分是环十二烷（14.03%）、1-十二醇(16.31%)、9-十六碳烯酸十四烷酯(5.06%)。
3 讨论
本文首次对亳白芷进行了挥发油成分的研究，确定了其主成分，为其药用提供了参考依据，并与川产白芷挥发油进行了对比。结果发现两种白芷在挥发油的成分组分及量上有差异，可能与品种、栽培及产地加工方法有关。
【参考文献】
［1］国家药典委员会.中国药典，ⅰ部［s］.：化学工业出版社，20xx：69，附录x d.
第二篇 宝干胶囊联合绞股蓝总苷片治疗大鼠高脂血症性脂肪肝的实验研究_药学论文
作者：李旭鸿，程卫东，脱承德， 董丽
【摘要】 目的探讨绞股蓝联合宝干胶囊治疗大鼠高脂血症性脂肪肝的作用机制。方法取 42 只大鼠随机分为正常对照组、模型组、绞股蓝组、宝干胶囊组以及绞股蓝联合宝干胶囊组。除正常对照组外，其余各组饲喂高脂饲料12周造高脂血症性脂肪肝模型，造模成功后给药组给予相应的药物治疗4周。检测血清总胆固醇（tc），甘油三酯（tg），天冬氨酸转氨酶（ast），丙氨酸转氨酶（alt），肝指数，超氧化物歧化酶(sod)活性和丙二醛（mda）以及肝组织的病理变化。结果与模型组比较，绞股蓝联合宝干胶囊可以降低tc，tg，ast，alt，mda和肝指数，升高sod活性。结论绞股蓝联合宝干胶囊对大鼠高脂性脂肪肝有良好的治疗作用。
【关键词】 绞股蓝总苷片； 宝干胶囊； 高脂血症脂肪肝； sd大鼠
随着我国经济的快速发展，生活水平的提高，人们的饮食结构也发生了变化，长期过食脂肪、高胆固醇、低纤维饮食导致脂肪肝患病率的升高。杨淑贤等人发现：脂肪肝与高脂血症之间关系密切，而且以甘油三酯增高为主要特征［1］ 。目前中药对脂肪肝有很好的治疗作用，宝干胶囊由临床效果良好的自拟通脉活血汤而来，故本实验对绞股蓝合宝干胶囊治疗大鼠高脂性脂肪肝的作用及其机制进行研究，以期为临床治疗提供依据。wWW.meiword.CoM
1 材料与仪器
1.1 动物
选用清洁级健康sd 大鼠42 只，雌雄各半，体重为(180 ±25) g，由兰州大学实验动物中心提供。
1.2 用药
胆固醇购自双旋生物培养基制品厂(批号: 20xx0606) 猪油，市售，自备。绞股蓝总苷片：由安康正大制药有限公司生产，批准文号：国药准字z10900032，20mg/片；宝干胶囊：青海普兰特药业有限公司（由黑芝麻、小蓟、酸枣仁、决明子、山药、肉桂等组成），批准文号：青卫食准字（20xx）第202号，0.3g/粒。其中绞股蓝总苷片研磨，与生理盐水制成混悬液待用。给药时宝干胶囊去掉胶囊，制成混悬液，待用。
1.3 试剂
总胆固醇（tc）、甘油三酯（tg）、天冬氨酸转氨酶（ast）、丙氨酸转氨酶（alt）试剂盒购自广州标佳科技有限公司，批号为：hn1530；超氧化物歧化酶(sod)和丙二醛（mda）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号：20xx0118；其他试剂均为纯级。
1.4 仪器
olympus au400 全自动生化仪（日本olympus 公司），万能显微镜（日本olympus公司生产）。分光光度计：岛津 uv-1700（日本岛津公司生产）。
2 方法
2.1 高脂模型的制备
实验动物用普通饲料适应性喂养，自由饮食1 周后，按照体重随机分为5组。正常组10只，普通饲料喂养。模型组8只，绞股蓝组、宝干胶囊组、宝干+绞股蓝联合用药组各8只，均喂高脂饲料，（配方：2％胆固醇+ 猪油10%+88％普通饲料，由兰州陆军总医院实验动物科提供）。实验动物自由饮水和进食，分笼(每笼4只) 饲养于（20 ±2）℃明暗各12 h 的环境中。实验第12周从模型组任选动物两只处死，取出肝脏，病理切片证明造模成功［2］ 。12周后，空白组普通饮食，模型组高脂饮食，均生理盐水灌胃；绞股蓝组0.09g／kg·d灌胃，宝干胶囊组0.92 g／（kg·d）灌胃，联合组0.09 g／（kg·d）绞股蓝+0.92 g／（kg·d）宝干胶囊灌胃，给药28 d。
2.2 测定方法
给药结束后隔夜禁食，次日以1 %乌拉坦溶液10 ml/ kg腹腔注射麻醉，从股静脉采血，离心、酶法测定tc，tg，ast，alt。严格按照试剂盒说明操作测sod，mda。采血完毕后处死，迅速取出肝脏，称重，10%福尔马林固定，送病理科石蜡包埋、切片、he 染色。
2.3 统计学处理
使用spss10. 0统计软件±s，p ＜0. 05 为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 各组大鼠肝功能指标结果见表1。表1 各组大鼠肝功能指标（略）与模型组比较，p＜0.01，p＜0.05
由表1可知，与模型组比较，绞股蓝总苷片对ast没有治疗作用；宝干胶囊对alt没有治疗作用；联合治疗组对alt、ast均有治疗作用（p<0.05）。宝干胶囊、绞股蓝总苷片和联合治疗组对tc、tg的均有显著统计学差异（p<0.05），3个治疗组间差异无统计学意义。
3.2 sod、mda的影响结果见表2。表2 各组大鼠sod、mda及肝重指数（略）与模型组比较，p＜0.01，p＜0.05
由表2可知，与模型组比较，宝干胶囊、绞股蓝总苷片和联合治疗组的sod值有显著的统计学差异（p<0.01)，各组之间在统计学上没有显著差异。宝干胶囊组mda值显示有较好的疗效（p<0.05），与之相比，绞股蓝组和联合治疗组的治疗效果(p<0.01)更显著。肝指数值显示，3个治疗组均有统计学的显著差异(p<0.05)，但3个治疗组间无统计学差异。
2.3 肝脏病理学变化
2.3.1 肉眼观察
正常组大鼠肝脏无异常变化。模型组肝脏体积明显增大，包膜紧张，边缘圆钝，整个肝脏呈奶黄色，并见局灶性黄白色变性灶，切面油腻。绞股蓝组和宝干胶囊组及联合用药组大鼠肝脏体积较空白组略大，包膜紧张，边缘薄，肝脏表面布满奶黄色的点状物，触之柔软。
2.3.1 光镜显示
正常对照组大鼠肝组织结构完整、清晰，肝小叶结构正常，静脉大而壁薄，肝细胞排列成肝索（见图1）；模型对照组大鼠肝组织可见中到重度脂肪肝，以肝腺泡区为主的弥漫性肝细胞空泡变性（见图2）。绞股蓝和宝干胶囊两个治疗组大鼠肝组织脂肪变以轻中度为主，脂肪变性程度较模型对照组降低，仍然有弥漫性的细胞空泡变性，空泡体积变小明显（见图3～4）。联合治疗组的肝组织结构清晰，脂肪变以轻度为主，仅有少量散在的细胞空泡（见图5）。
3 讨论
高脂血症引起脂肪肝与长期过食脂肪、高胆固醇、低蛋白饮食，体重增加过快、内分泌失调及代谢疾病相关。因部分脂肪肝可进一步演变为脂肪性肝炎、肝纤维化及肝硬化等严重病理状态，因此需要及时的治疗以阻止其进一步发展或使其得以逆转。祖国医学根据发病证候辨证分型的归纳，认为高脂血症病人多涉及肝、脾、肾三脏功能失调，其因多饮食不节、嗜食肥甘、膏粱厚味，内因肾气虚衰，气化不利，脾胃运化输布失调，肝胆疏泄调畅失司，使机体升降、受纳功能失调，病理产物水湿、痰浊、淤血、湿热生成并淤积体内，进一步促进了脏腑功能失衡，造成脂质代谢紊乱。临床以肝肾两虚和痰湿痹阻最多见，尤强调肝脾失调是本病的病理基础，“痰”“淤”是其病变之标。治病必求其本，对高脂血症治则上应健脾补肾，益气养阴以扶正，化痰利湿以祛邪［3］。临床上常应用降脂药物治疗，但由于大多数这类药物本身具一定的肝损作用，因而限制了其在脂肪肝治疗中的应用［4］，而中医中药对其确有比较好的作用，所以我们选用了绞股蓝总苷片和宝干胶囊作为研究药物进行了研究。
绞股蓝总苷是从天然中草药绞股蓝中提取并精制而成，其中含有多种人参皂苷，人体必需氨基酸及微量元素，具有显著降低胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白及升高高密度脂蛋白的作用，从而阻止脂质在细胞内沉积，特别是阻止脂肪酸在肝细胞内的堆集，维护线粒体的功能，进而减少或抑制肝星状细胞的激活与增殖［5］，减轻肝细胞脂肪变性及肝纤维化［6］。但绞股蓝对转氨酶ast的影响不大，单纯降脂治疗脂肪性肝炎，效果不很理想。绞股蓝降脂作用缓和，无明显不良反应及毒副作用，对肝脏无明显损伤。
宝干胶囊由黑芝麻、小蓟、酸枣仁、决明子、山药、肉桂等组成。本方有补肝益肾调脾兼清热化瘀的作用。山药、肉桂补气暖脾胃，二者共用脾胃健运，则痰浊不生；黑芝麻、肉桂、决明子、山药共同补肝肾，养阴益精血，肝体阴而用阳，肝血得补，肝气得以疏泄。肝脾功能得以恢复，则机体升降、受纳功能恢复平衡；小蓟祛淤消肿，能清痰热而化淤，与山药肉桂合用可以祛痰湿，清痰热化淤血，且三者同用凉而不寒，暖而不热。诸药合用，则肝脾肾同补，痰湿、痰热、痰淤得祛。本方性味平和，偏于治本，补中有泻，寒热共用，是适合较长时间使用的食疗药物。现代药理研究；决明子能抑制血清胆固醇的升高［7］；山药可增强肌体的免疫功能，有抗老延寿作用，能明显降低四氧嘧啶所致高血糖小鼠的血糖［8］；酸枣仁可降血脂和防治动脉粥样硬化［8］。因此，宝干胶囊对高脂血症性脂肪肝具有良好的治疗作用。
宝干胶囊是食字号保健治疗药，和绞股蓝总苷片联合用药之后，可显著而全面的降低转氨酶，tc、tg、mda，还可升高sod活性。
尤其是绞股蓝总苷片对ast没有治疗作用，宝干胶囊对alt没有治疗作用，而联合治疗组对alt、ast均有治疗作用，所以宝干胶囊和绞股蓝联合治疗整体疗效显著，治疗全面，且价格低廉，无毒副作用，是治疗脂肪肝的理想药物。
【参考文献】
［1］杨淑贤，杨泽之.机关干部中脂肪肝及其相关致病因素的探讨［j］.临床消化病杂志，1998,10(1):8.
［2］钟 岚,范建高.肥胖、高脂血症性脂肪性肝炎模型的建立［j］.实验动物科学与管理，2000,17(2):16.
［3］关宝莲，齐红羽.高脂血症的中医辨证分型研究［j］.山西中医20xx,21(1):41.
［4］曾民德.降血脂药物在脂肪肝治疗中的应用［j］.中华肝脏病杂志2000,8(2):116.
［5］mcclain gj. barves, peaciue i, et al. cytokines in alcoholic liver disease［j］. semin l iverdis, 1999,19:205.
［6］陆伦根，曾民德，李继强，等.脂质的kupffer细胞对肝星状细胞增殖的影响［j］.胃肠病学，1998,3(4):214.
［7］雷载权.中药学［m］.上海：上海科学技术出版社，20xx：57.
［8］吴贻谷,宋立人.中华本草［m］.上海：上海科学技术出版社，1998：2118，1151.
第三篇 DNA分子标记在中药鉴定中的应用及发展趋势分析_药学论文
作者：李力， 徐永莉， 张月云， 赵成坚
【摘要】 目的对dna分子遗传标记技术在中药材鉴定领域的应用作一综述。方法通过查阅20世纪90年代以来发表的文献进行归纳。结果dna分子遗传标记技术具有微量、快速、特异性强、准确可靠、对样本要求较低的特点；使用较多的方法主要有rapd、issr、its标记以及rrna基因序列技术。同时，dna分子标记技术也存在着使用局限、对实验硬件和从业人员的技术要求高、成本较高、技术复杂度高、对不同部位入药的药材仍然难以区分以及无法用于成药、复方、提取液鉴定等弱点。结论dna分子遗传标记作为中药材鉴定的方法还有待发展和完善。
【关键词】 dna分子遗传标记； 中药材； 鉴定
abstract：objectivethe paper summarizes the researches of application of dna molecular markers in chinese medicinal materia.methodsinduction and ysis were used by referring to literature released since 1990s . resultsdna marker technologies have characteristics of trace,rapid,peculiarity, accuracy and credibility, lower requirements for the sample. random amplified polymorphic dna (rapd),inter-simple sequence repeat (issr), interial transcribed spaoers (its) and rrna gene sequencing technology are often used.however, dna marker technologies have some disadvantages that employees are required special skills,the cost is high and the technique is complicated,while it is difficult to distinguish different parts of chinese medicinal materia used medicinally and identify patent medicine, chinese medicine complex prescription and the extract of chinese medicinal materia. conclusionthe methods of chinese medicinal materia identification by dna molecular markers need to develop and improve.
key words：dna molecular marker； chinese medicinal materials； identification
针对我国药材种类繁多,来源复杂且品种混淆情况严重的状况, 为了保证临床用药的安全及质量和疗效,广大中医药领域的专家学者多年来一直都致力于寻找更加科学的鉴定方法来解决这一难题。WWw.meiword.COM随着当今生命科学不断取得重大突破, 其中分子生物学技术以其准确性高、重复性好等特点尤为引人瞩目。dna分子标记大致可分3类:首先是以电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记技术,其中代表技术有rflp分子标记技术；第2类是以电泳技术和pcr技术为核心的分子标记技术,实际使用较多的代表技术为:rapd、简单序列重复间区标记技术(inter-simple sequence repeat issr)和aflp(amplified restriction fragment polymorphi)。第3类是以dna序列为核心的分子标记技术,其代表性技术有its(interial transcribed spaoers)测序技术。本文仅就最近十几年来dna分子标记技术在中药鉴定方面的应用作一， 并就其应用前景进行讨论和展望。
1 经典的dna分子标记技术
此类技术的代表是限制性片断长度多态性 (restriction fragment length polymorphi，rflp)。
rflp是最早发展的分子标记，是由bostein首先提出，soller和beckman最先应用于品种鉴别和品系纯度的测定，这是最早发展的分子标记技术。其基本原理是利用限制性内切酶酶切不同个体基因组dna后，与同位素或非同位素探针标记杂交，从而显示与探针含同源顺序的酶切片段在长度上的差异。rflp探针的来源主要是rg克隆和cdna克隆，其中cdna探针保守性较强，许多同科物种cdna探针都可以作为通用探针。在实际应用过程中，人们普遍感到经典的rflp技术须经酶切、电泳、southern转移、与探针杂交、放射自显影等步骤, 在实际应用中很不方便，费时费力,并受到探针来源的限制，多态性检出效率低(只能检测探针长度内切酶识别位点上的变异)。同时要求的dna量较大,实验材料必须新鲜, 因此难以适用于干燥药材的鉴定,目前在中药鉴定领域已很少使用,已归为被淘汰的技术。
在多源性中药材如伞形科北沙参、柴胡,菊科苍术属豆科甘草属,羽扇豆属（lupinus sp．），yamazaki m,茄科澳茄属(duborsia s ) mizukami h,3种苍术mizukami h的基原鉴定、资源及其地理品系(居群)间亲缘关系研究方面有了一些报道。
2 基于pcr的dna分子标记技术
此类标记技术的代表为:rapd（random amplified polymorphic dna)、简单序列重复间区标记技术(inter-simple sequence repeat issr)和aflp(amplified restriction fragment polymorphi)。
2.1 随机扩增片段长度多态性标记(random amplified polymorphic dna，rapd)rapd技术是由美国的williams与welsh两个研究小组于1990年同时提出的一种dna分子标记技术。williams等称之为rapd，welsh等称之为ap-pcr(arbitarily primed pcr)，此技术利用单一的10个碱基寡核苷酸作为引物，对基因组dna进行pcr扩增，经琼脂糖凝胶电泳来检测dna序列多态性。rapd标记只需微量dna,且对受试基因组无特定要求(不须知道受试基因dna的背景材料),检测灵敏、方便、多态性强，可以检测出rflp标记不能检测的重复顺序，可填补rflp图谱空缺，适用于种质资源的鉴定和分类、目标性状基因分子标记、遗传图谱的快速构建等研究，也可用于亲缘关系等的研究。相对于其他几种分子标记, rapd标记是在中药鉴定领域用得最多的分子遗传标记技术, 并对中药鉴定研究产生了深刻的影响。rapd技术自问世以来 ，在中药鉴定中主要用于中药混淆品、代用品的鉴定,多来源中药的鉴定,名贵中药的鉴定,动物类中药的鉴定等。
从1996年以来，黄璐琦等［1～3］等分别对天花粉、西洋参等进行了鉴别研究，证明了rapd法作为鉴别动植物类生药是可行的。
2000～20xx年，于燕莉等［4～13］分别对金银花、姜黄属药材和山药、射干类药材射干及混淆品鸢尾、野鸢尾、蝴蝶花、德国鸢尾、近缘物种金线莲母(金线莲) 与金线莲公(无线金线莲)、泽泻、麻黄、灵芝、厚朴、地黄和海风藤等进行了研究,从分子水平定性地揭示道地药材的遗传变异,得出同种异地药材所形成的不同的居群，具有不同的遗传特征。李颖等［14］分别对广藿香和独活药材进行探索, 并建立了鉴别方法。
2.2 aflp技术扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphi, aflp)标记技术是1993年由荷兰科学家zabeau和vos发展起来的一种检测dna多态性的方法， aflp是一种rflp与rapd相结合而又不使用分子杂交技术的分子标记手段，被誉为新一代的分子标记技术。它的原理是基于对基因组dna双酶切经pcr扩增后的限制片段进行选择。使用特定的双链接头与酶切dn段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板dna进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，所以，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可以被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上的dna指纹的有无来检出多态性。由于aflp预先不需要知道dna序列的情况，但获得的指纹信息位点要比rapd技术更为丰富。相比之下。最后完成aflp实验的成本比用rapd方法的成本低，更省时间、更方便，而且准确性更高，数据更可靠，技术难度也不大。
2000年以来，马小军等［15～19］用aflp标记分别对人参、西洋参、石斛以及天麻等进行，结果显示，aflp指纹技术具有稳定性高、重复性好等优点，得到了清晰的aflp指纹图谱，该体系具有良好的稳定性和重复性。
2.3 issr标记技术简单序列重复区间（inter-simple sequence repeat，issr）技术又称为锚定简单序列重复技术（anchored simple sequence repeat，assr）由加拿大蒙特利尔大学的zietkiewicz等于1994年提出。它用锚定的微卫星dna为引物，即在ssr序列的3’端或5’端加上2～4个随机核苷酸，在pcr中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间dn段进行pcr扩增。所扩增interssr区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨，扩增带多为显性表。issr标记技术特点：实验操作简单、快速、高效，不需要繁琐地构建基因文库、杂交和同位素显示等步骤。issr标记技术结合了rapd标记技术和ssr标记技术的优点，耗资少，模板dna用量也少。
20xx年以来，此标记技术受到许多学者的青睐，邱英雄等［20～31］分别对明党参和川明参、南北五味子、罗汉果、金花茶、怀区地黄、铁皮石斛和黄精、麦冬、金钗石斛、丹参和半夏等药材的基因组dna进行pcr扩增，建立并优化了issr-pcr反应体系，结果证明issr标记可以作为不同产地药材鉴别的有效分子标记。
此外，20xx年以来，李磊等［32～36］分别对4种叶型性状半夏和掌叶半夏、山茱萸、银杏、益智和乌头等药材利用issr分子标记进行了，并取得良好结果。
2.4 dna序列技术以dna序列为核心的分子标记技术。建立在pcr技术基础之上的dna测序技术(dna sequencing)的开发使dna分子标记技术取得了又一次的突破性进展。
动植物在进化过程中，其基因会发生碱基的重排、替代等，从而导致基因序列的差异。通过检测其dn段序列的差异，即可将不同的种区别开来。近年来，由于dna测序技术的发展以及人们对一些基因结构、功能的进化规律认识的更加深入，一些基因已用于动植物的进化与分类、物种鉴别研究。利用已知基因的结构、序列，可以为pcr引物的设计及目的基因的扩增提供前提条件。而基于pcr的dna直接测序技术，极大地提高了dna序列的效率，促进了该项技术的应用研究。目前用于中药dna测序的基因主要有植物叶绿体基因组的rbcl，mat k rpoc 等；植物核基因组的rrna、its等；动物线粒体基因组cytb基因等 ，这些被选基因的共同特点是进化速率差异大，基因序列变异大，基因序列均匀地分布于整个基因组，分辨率高，一般用于种级以上的分类系统研究以及研究动植物的亲缘关系与进化等。
马小军等［37～40］20xx年分别通过测定山参、大戟、巴戟天以及细辛和柴胡的序列，获得了可喜的效果 。
此外，徐红等［41～47］20xx年分别对川芎、西洋参、竹节参、石斛、姜黄、大黄、当归及小秦艽、肉苁蓉、广藿香、太子参、葛根等进行了药材鉴别，根据序列能够将研究对象区别开。
动物类药材多用线粒体细胞色素b基因片段的序列变异鉴别药材。1998年吴平［48］通过对乌龟、中华鳖和山瑞鳖线粒体12s rrna基因片段序列来区分正品和混淆品；还通过扩增约450bp的12s rrna和约490 bp的cytb基因片段对海马作了dna序列，可作为其它动物药材干样品鉴定的参考。1999年王义权等［49］扩增了乌梢蛇及其混淆品的cytb基因片段，通过比较蛇的cytb基因246 bp的同源dna序列，可以准确区分乌梢蛇及其混淆品。
3 评价与展望
3.1 评价中药材品质鉴定是中药质量控制的首要环节，多年来人们一直在寻找科学有效的鉴定中药材的方法，从应用的现状不难看出dna分子标记技术在该领域的应用已经取得了一些成绩。dna分子标记技术作为中药材品质鉴定方法之一具有以下几点优势：微量、快速、特异性强、准确可靠，且不受药材生长发育阶段、供试部位、环境条件、产地、采收季节、贮藏等因素的影响，对样本要求较低，无论是药材还是成药、甚至是粉末都可以用来鉴别；归纳起来dna分子标记技术已应用于几个方面：①用于中药真伪、近缘药材及代用品鉴别，使用的方法主要有rflp，rapd，ap-pcr，its等标记；②药材的野生类型与栽培品种的研究，使用的方法主要有rapd，aflp；③粉末、中成药鉴别，使用的方法主要有rapd，rt-pcr；④本草考证与出土中药研究，使用的方法主要是测序技术；⑤道地药材研究，使用的方法主要有rapd，rflp ，aflp标记和its与rrna基因序列技术。文献报道的研究人员主要集中在中国、日本，但已显示了强劲的发展势头。另一方面，dna分子标记技术在中药材鉴定中的应用也存在着明显的不足。主要表现在几个方面：①作为鉴别药材的方法学的研究，投入的人力物力都还很有限，与中药其他方面研究的结合还未开展，所以从方法学上来讲，中药材的分子鉴定方法还需要发展才是。②使用还很局限，由于分子标记技术对实验室硬件和从业人员的技术要求很高，再加上成本也较高，所以真正用于中药材鉴别的方法还很少，已涉及的中药品种也很有限，从文中可看出，仅rapd、issr以及测序技术使用较多，涉及的中药品种也只有几十种；正因为技术复杂度的制约，此类鉴别技术对于生产收购第一线的人员仍然显得复杂，还无法推广使用。③数据所使用的软件还很局限，测序后对数据进行，这是判断药物近缘关系的关键步骤，数据必须借助多种软件及适当的方法，以往多采用的nei(1972)方法现已显单一了，目前用于其他生物技术的软件早已多元化了,且很多新的软件主要应用于中药材的遗传多样性当中。④dna分子标记技术对不同部位入药的药材仍然难以区分，各部具有同样dna标记式样。对于成药、复方、提取液的dna标记还未见报道。
3.2 展望从分子标记技术的发展来看，前后也就二十多年的时间，它也是随着分子生物学技术及信息技术的发展而发展的，不可否认的是分子标记技术肯定是本世纪的主流技术。除了以上分子标记技术外，现在还发展有单核苷酸多态性标记技术（snp）、相关序列扩增多态性标记技术（srap）、靶位区域扩增多态性标记技术（trap）、荧光原位杂交技术（fish）、变性梯度凝胶电泳技术（dgge）等［50］，这些技术已被用于其它一些领域的研究之中，因此，作为方法学的研究，在中药鉴定领域还应该加大人力物力的投入，选择和发展出更适合中药鉴定或针对不同鉴定对象的鉴定方法，最终推动分子生物学技术对更多的中药品种或剂型进行鉴定。同时我们也看到，仅仅依靠分子标记技术在相当长的时期内还不可能解决中药材和中药制剂的鉴定和质量控制，那么我们就还必须要同时选择多种方法进行协同，比如分子标记技术与细胞学标记技术、生化标记技术、高效液相及核磁共振等技术的协同使用，通过多种技术的结合来达到最终准确鉴定中药材或中药复方制剂的目的。
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第四篇 绒柄牛肝菌有效部位指纹图谱定性和有效成分定量分析研究_药学论文
作者：王元忠，刘鸿高，张金渝，李涛
【摘要】 目的建立绒柄牛肝菌的反相高效液相色谱定性和定量方法。方法反相高效液相色谱（rp-hplc） planetsil c18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（15∶85），流速为1.0 ml·min-1，检测波长为261 nm，柱温为室温。对绒柄牛肝菌有效部位（甲醇提取部位）进行指纹图谱定性，对绒柄牛肝菌中的有效成分腺苷进行定量测定。结果在色谱条件下，11份不同绒柄牛肝菌中甲醇有效部位的rp-hplc指纹图谱中可检出11个相对稳定的色谱峰，其中确定出9个共有峰作为定性鉴别的指标峰；绒柄牛肝菌中腺苷的含量为0.146%～0.493%。结论绒柄牛肝菌有效部位rp-hplc指纹图谱定性和有效成分定量方法具有较强的针对性和准确性，可用于绒柄牛肝菌及药用真菌的质量控制。
【关键词】 绒柄牛肝菌； 腺苷； 指纹图谱； 反相高效液相色谱
绒柄牛肝菌boletus tomentipes earle，又名大巴菌、黑牛肝、毛脚牛肝菌，属于担子菌亚门（basidiomyctina）、层菌纲（hymenomycetes）、伞菌目（agaricase）、牛肝菌科（boletaceae）中的一种［1］。wWW.meiword.cOM我国主要分布于云南，生于针阔叶林中地上，散生。全世界已知的牛肝菌属约有1 024种或变种，我国已知的可食用的就有199种［2］。据文献记载，牛肝菌子实体富含蛋白质、碳水化合物、钙、磷、铁、核黄素等营养成分，含有人体必需的8种氨基酸，还含有腺嘌呤(adenine)、胆碱(choline)和腐胺(putrescine)等生物碱，可治疗腰腿疼痛、手足麻木、四肢抽搐，还可治疗妇女白带症［3］ 。牛肝菌子实体的水提物对小鼠肉瘤s180的抑制率达90%，对艾氏腹水癌的抑制率为80%，是中成药“舒筋丸”的原料之一［4］。
众多研究表明，同一物种不同个体由于来源和产地不同，其有效成分含量会有很大差异［5～7］。为了确保绒柄牛肝菌药理作用，本研究建立了以绒柄牛肝菌有效部位为基础的hplc指纹图谱定性和有效成分定量方法，并通过对11个不同地区的样品测定研究，确定了绒柄牛肝菌指纹图谱的共有峰和指标峰以及腺苷的含量范围，为有效准确地定性和定量鉴别不同来源的大型药用真菌提供一种方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
shimadzu lc-20xxa高效液相色谱仪, spd-m10avp二极管阵列检测器， class-vp色谱工作站；色谱柱为planetsil-c18 (4.6 mm×150 mm，5 μm) ；色谱柱恒温装置。超纯水器（mill-qplus usa）；kq2200e型超声波仪（舒美超声仪）；ae100s万分之一电子天平（梅特勒－托利多）。
流动相甲醇为色谱纯（fisher公司 美国）；水为三重蒸馏水（自制）；对照品腺苷（中国药品生物制品检定所提供）。其余所用试剂均为纯。
1.2 材料来源
见表1。表1 实验材料（略）
1.3 样品制备腺苷标准溶液：精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的腺苷标准品，加甲醇制成每毫升含20 μg的溶液，作为对照品溶液。
取样品粉碎混匀，准确称取0.500 0 g试样（精确至0.000 01 g）于心形瓶中，精密加90%甲醇10ml，70℃水浴回流提取30 min，放冷，再称定重量，用90%甲醇补足减失的重量，摇匀，以5 000 r/min离心5 min。经0.45 μm滤膜过滤后供液相色谱用。
2 结果
2.1 色谱条件色谱柱为planetsil-c18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）及其c18保护柱。流动相a为甲醇、流动相b为水；梯度洗脱；流速1 ml/min；检测波长261 nm；柱温30 ℃；进样量10 μl。
2.2 方法学考察结果
2.2.1 系统适应性实验吸取对照品溶液5 μl注入色谱仪，记录色谱图，理论塔板数按腺苷计算在5 000以上。在此条件下对腺苷对照品溶液，供试品溶液进行测定，供试品溶液色谱图中与对照品溶液色谱图相同位置具有吸收峰，且对照品测定无干扰。
2.2.2 线性关系考察
精密吸取2，4，6，8，10，12，14，16μl腺苷对照品溶液，按上述条件分别进样，以腺苷浓度（mg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程：y=1.46×106 x-1.22×105，r2 =0.999 69，(n = 7),表明腺苷在1.2～ 96 μg/ml范围呈良好的线性关系。
2.2.3 仪器精密度和对照品溶液稳定性实验精密吸取腺苷对照品溶液，在上述条件分别进样6次，计算腺苷的峰面积，rsd＝0.678％，表明仪器精密度良好。
精密吸取腺苷对照品溶液，于配制后的0，2，4，8，14，26，48 h测定，其峰面积rsd＝1.04％，表明腺苷对照品溶液在48 h内稳定。
2.2.4 样品溶液的稳定性实验取同一批号的样品，分别在0，2，4，8，14，26，48 h检测指纹图谱，各色谱峰的相对保留时间无明显变化，单峰面积占总峰面积5％以上的色谱峰与参照峰的峰面积比值也无显著变化。rsd＝1.454％，表明样品溶液在48 h内稳定；仪器精密度可靠，符合指纹图谱要求（国家药监局，2000）。
2.3 指纹图谱的建立分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪中，记录60 min色谱图即得。比较11批供试品的hplc图谱发现，其中有6个色谱峰是11批供试品所共有的。计算图谱中各共有峰色谱峰相对于腺苷色谱峰（3号峰）的相对保留时间（a=ti/t8）和相对峰面积值（ar=ai/a总×100%）。结果见表2～3。表2 不同地区绒柄牛肝菌hplc图谱主要峰相对保留时间比较（略）表3 不同地区绒柄牛肝菌hplc图谱主要峰相对保留时间比较（略）
2.4 共有峰确定在11份绒柄牛肝菌供试样品的hplc图谱中，由色谱峰相对保留时间（a）的稳定性（相对偏差小于3%），可以确定的共有峰有9个，其相对保留时间从0.108 ～ 2.180；同时分别计算11个样本主要峰的总面积（a总）、平均总面积（a总）以及总面积的相对偏差，舍去总面积相对偏差小于-40%的（样品编号为3，4，10），最后其余样本确定绒布牛肝菌共有峰1，3，5，6，7，8，9，10，11号峰，作为绒柄牛肝菌指纹图谱定性的指标峰。用此定性指标鉴定11样本，结果所有样本均为绒柄牛肝菌。
2.5 绒柄牛肝菌中腺苷含量测定按“1.3”方法处理，进样5 μl，测得峰面积积分值，计算绒柄牛肝菌中腺苷含量。结果见表4。
3 讨论
rp-hplc法虽然是一种有效的分离方法，但由于绒柄牛肝菌成分复杂，性质各异，即使使用梯度洗脱也很难获得理想的分离结果。使用梯度洗脱增加了实验操作和重现性难度，而且难以突出地反映药用真菌与主要药理作用相关的有效成分群，从而在质量控制方面无法有效地做到“纲举目张”。本实验应用反相高效液相色谱技术，建立了以绒柄牛肝菌指纹图谱定性和有效成分定量的方法。这种方法是在物质基础上，以绒柄牛肝菌为质控对象，并利用现代仪器技术同时进行定性和定量，增强了方法的有效性和针对性。实验中采用等度洗脱方式，色谱条件容易控制，可保证结果的重复性。表4 不同地区绒柄牛肝菌中腺苷含量测定结果（略）
在色谱条件下，绒柄牛肝菌的hplc图谱中可以检出11个色谱峰。通过对11份绒柄牛肝菌供试样品的hplc图谱中主要峰相对保留时间（a），其相对误差（rsd）均小于3%，表明主要色谱峰在hplc图谱中的相对位置是稳定的，可以作为定性鉴别的指标参数；同时，测定各样本主要峰的总面积（a总），以反映在不同样本中的绝对含量，而各总面积的相对偏差则可以比较在不同样本中的相对含量，舍去相对含量较小的样本，由其余样本确定了绒柄牛肝菌定性鉴别的指标峰有9个，相对保留时间分别为0.108，0.291，0.568，0.667，0.710，1，1.156，1.470，2.180，将其用于对11个样本的定性鉴别。结果表明，虽然11个样本中腺苷在含量上差别很大，但均含有9个指标峰，故认为它们是绒柄牛肝菌。
本研究选用腺苷作为标准品，据文献资料报道，腺苷在大型真菌中的相对含量较为适中；腺苷为辅酶类药物,它能参与体内能量代谢及蛋白质的合成，具有提高各种酶(特别是辅酶a) 的活性及改善机体代谢作用，因此是生物体生长代谢所必须、普遍存在的物质，以其作为标准品具有可比性。
在本实验中，我们将11个样本在相同实验条件下，以腺苷为对照品，通过hplc检测出的腺苷成分含量在0.146%～0.493%之间。表明不同生长环境和贮藏时间对有效成分含量影响很大，绒柄牛肝菌质量须严格控制。在有效成分不完全明确的前提下，制定药用真菌的指纹图谱，对于有效地控制其质量，具有重要意义。
由于大型药用真菌所含化学成分多而复杂，其来源品种、产地、生长过程、采收时间、储藏条件等诸多因素对质量都有一定影响。大型药用真菌质量的传统评价方法已经不能满足质量评价的需要，因此采用现代的科学技术建立大型药用真菌定性定量标准已经非常必要和迫切。
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第五篇 蒙药地格达-4味汤对小鼠化学性肝损伤的实验研究_药学论文
【摘要】 目的观察地格达-4味汤对d-半乳糖胺(d-glan)、硫代乙酰胺(taa)所致小鼠肝损伤的防治作用。方法以护肝片作阳性对照,用不同肝毒剂造成小鼠急性肝损伤模型,分别测定动物血清相关指标,用t检验法比较各组间差异。结果地格达-4味汤组可降低因d-glan所致肝损伤小鼠的alt及ast (p<0.05)；明显降低因taa所致肝损伤小鼠的alt及ast (p<0.01)。模型组肝组织学改变主要表现为碎片状坏死；护肝片组可见散在点状及小碎片状坏死；地格达-4味汤组可见散在点状坏死，有炎细胞浸润。结论地格达-4味汤对以上不同肝损伤模型有一定的防治作用,本研究为该药的功效及应用提供了实验依据。
【关键词】 地格达-4味汤; d-glan; taa; 急性肝损伤
abstract：objectiveto observe the protective and treatment action of digeda-4 powder for d-glan and liver lesion of mice induced by taa.methodspositively controlled with huganpian, the above-noted liver-toxic agents were administered to make acute liver lesion of mice to measure the relative indices of animal serum.method of t-test was used to check the difference between the groups.resultsdigeda-4 powder decreased the serum alt and ast of liver lesion mice induced by d-glan(p<0.05);and obviosly lowered the the serum alt and ast of liver lesion micen induced by taa(p<0.01). the change of hepatic tissues in model groups showed the piecemeal necrosis;the hepatic tissues in positive control groups showed scattered punctiform and dimin piecemeal necrosis;the hepatic tissues in digeda-4 powder groups showed scattered punctiform and dimin piecemeal necrosis;also it was infiltrated phlegmonosis cell.conclusiondigeda-4 powder has protective and treatment action on the above mentioned different liver lesion models to some extent.the test is likely to provide the experimental basis for the effect and application of this herb.
key words：digeda-4 powder ; d-glan; taa; acute liver lesion
地格达-4味汤（又叫肋柱花四味汤）是蒙医常用方剂之一。WWW.meiword.COM本复方由肋柱花、瞿麦等蒙药材组成, 具有清血热、分解精华与糟粕等功效。主要用于紊乱血热症，血热相搏，肝胆湿热，咽喉肿痛，口渴干燥等多种病证［1］。该实验主要观察了地格达-4味汤对d-glan和taa所致肝损伤的保肝降酶作用。
1 材料
1.1 动物昆明小鼠,体质量18～22 g,雌雄各半。合格证书：scxk(辽)20xx-0016，由沈阳医学院实验动物中心提供。
1.2 药品及仪器
地格达-4味汤，内蒙古民族大学蒙医药学院内蒙古自治区教育厅重点实验室提供。d-半乳糖胺（d-glan），sigma公司，批号：58461。硫代乙酰胺（taa），中国医药集团上海化学试剂公司，批号：458666。天门冬氨酸氨基转移酶(ast)：中生北控生物科技股份有限公司，批号：080120。丙氨酸氨基转移酶(alt)试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司，批号：080122。全自动生化仪(pronto-e型号),离心机(ld4-40),精密电子天平(bs210s型)。
2 方法
2.1 地格达-4味汤对d-glan所致小鼠急性肝损伤的影响
［2］取小鼠48只，随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组、地格达-4味汤组等4组，每组12只。正常对照组和模型组给予0.9%生理盐水20 ml/kg灌胃；阳性对照组给予护肝片0.6 g·kg-1灌胃；地格达-4味汤组给予地格达-4味汤4.3 g·kg-1灌胃，1次/d，连续1周。于末次给药后1h，除空白组外，其余3组小鼠均腹腔注射d-glan 800 mg·kg-1之后禁食不禁水，24 h后断头处死动物，2 500 r·min-1离心10 min,取血清测丙氨酸氨基转移酶（alt）和天门冬氨酸氨基转移酶（ast）。取肝大叶相同部位组织，用10％ 福尔马林固定，切片，he染色，光镜观察组织变化。
2.2 地格达-4味汤对taa所致小鼠急性肝损伤的影响
［3］取小鼠48只，随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组、地格达-4味汤组等4组，每组12只。正常对照组和模型组给予0.9%生理盐水20 ml/kg灌胃；阳性对照组给予护肝片0.6 g·kg-1灌胃；地格达-4味汤组给予地格达-4味汤4.3 g·kg-1灌胃，1次/d，连续1周。于末次给药后1h，除空白组外，其余3组小鼠均腹腔注射taa 80 mg·kg-1之后禁食不禁水，24 h后断头处死动物，2 500 r·min-1离心10 min,取血清测丙氨酸氨基转移酶（alt）和天门冬氨酸氨基转移酶（ast）。取肝大叶相同部位组织，用10％ 福尔马林固定，切片，he染色，光镜观察组织变化。
2.3 统计学处理各组数据均用spss10.0统计软件做统计学处理，结果以±s表示,应用两样本均数的t检验判定其差异,以p<0.05作为显著性差异的标准。
3 结果
3.1 地格达-4味汤对d-glan所致小鼠急性肝损伤血清酶变化的影响
结果见表1。表1 地格达-4味汤对d-半乳糖胺所致小鼠急性肝损伤的影响（略）
由表1结果可见，地格达-4味汤组小鼠血清alt及ast较模型组降低。表明该药可降低因d-glan而造成的肝损伤升高的血清转氨酶。
3.2 地格达-4味汤对d-glan所致小鼠急性肝损伤组织形态学改变的影响
见图1，表2。表2 地格达-4味汤对d-半乳糖胺所致小鼠急性肝损伤组织形态学改变的影响只（略）
由组织学图1及表2可见，模型组普遍存在肝组织碎片状或小碎片状坏死灶，并伴有大量淋巴细胞、中性粒细胞浸润，坏死区周围可见肝细胞脂肪变性和嗜酸性变；护肝片组可见散在点状及小碎片状坏死，以被膜下及小叶区为著，伴有淋巴细胞，以轻度肝细胞脂肪变性和水肿为主要改变。地格达-4味汤组肝组织损伤状况较轻，可见散在少数点状及小碎片状坏死，有淋巴细胞和中性粒细胞浸润，主要表现为肝细胞脂肪变性和水肿。表明地格达-4味汤对d-glan所致肝组织病理损伤具有保护作用。
3.3 地格达-4味汤对taa所致小鼠急性肝损伤血清酶变化的影响
结果见表3。表3 地格达-4味汤对硫代乙酰胺（taa）所致小鼠急性肝损伤的影响（略）
由表3结果可见，地格达-4味汤组小鼠血清alt及ast较模型组明显降低。表明该药可明显降低因taa而造成的肝损伤升高的血清转氨酶。
3.4 地格达-4味汤对taa所致小鼠急性肝损伤组织形态学改变的影响见图2及表4。表4 地格达-4味汤对硫代乙酰胺（taa）所致（略）
由组织学图2及表4可见，模型组与正常组比较肝小叶结构不完整，可见肝组织碎片状坏死灶，并伴有大量淋巴细胞、中性粒细胞浸润，坏死区周围可见肝细胞脂肪变性和嗜酸性变；护肝片组可见散在点状及小碎片状坏死，以被膜下及小叶区为著，伴有淋巴细胞和少量再生肝细胞，以轻度肝细胞脂肪变性和水肿为主要改变。地格达-4味汤组只见少数小点状坏死，内有少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润，主要表现为肝细胞脂肪变性和水肿。表明地格达-4味汤对taa所致肝组织病理损伤具有保护作用。
4 讨论
药理实验研究表明,d-半乳糖胺引起的化学性肝损伤模型,是目前国际上常用的肝炎模型之一,其中毒机制的研究也较为深入。d-半乳糖胺通过引起肝脏的代谢紊乱而导致肝损伤。一般认为, d-半乳糖胺与肝细胞内尿苷二磷酸(udp)结合而形成(udp-半乳糖胺复合物,使尿苷三磷酸(utp)耗竭,尿苷类化合物环化不能进行,致使rna和蛋白质合成受阻,质膜结构蛋白质合成减少,使udpg-焦磷酸转移酶活性和数量均下降,引起糖(包括糖原和粘多糖)和磷脂代谢障碍,膜损伤加重, ca2+内流增加,最后细胞中毒死亡。此模型中,肝细胞破损后释放出谷丙和谷草转氨酶,使血清中其二者均升高［3］。硫代乙酰胺,干扰rna从细胞核到细胞质的转运过程,影响蛋白质的合成。其可能损害肝细胞膜,致使细胞的离子环境破坏,导致肝细胞坏死［3］。
实验研究表明, 地格达-4味汤对动物因d-半乳糖胺、硫代乙酰胺所造成的急性肝损伤,有一定的防护作用。该药可降低d-半乳糖胺、硫代乙酰胺所致肝损伤小鼠的血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶。地格达-4味汤对肝组织损伤坏死、变性有明显的改善作用。表明地格达-4味汤对d-半乳糖胺、硫代乙酰胺所致肝组织病理损伤具有保护作用, 实验结果与该药血热相搏，肝胆热等有相符之处，为其临床应用及今后的有效开发利用提供了依据。
【参考文献】
［1］白清云．中国医学百科全书·蒙医学［m］．上海：上海科技出版社，1992:270.
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［3］曲莉莎，曾万玲，梁光义．民族药马蹄金提取物对d-glan、taa、anit所致小鼠化学性肝损伤的药理作用研究［j］.中国医药学报，20xx,18(2):84.
第六篇 茅苍术及其组培栽培品挥发油气质联用分析_药学论文
作者：谷巍，邓海山，巢建国，张莹，候芳洁
【摘要】 目的研究茅苍术的挥发油，为茅苍术资源的野生抚育及可持续利用提供基础和科学依据。方法用气相色谱和质谱联用技术测定不同产地茅苍术挥发油，并进行聚类。结果道地产区茅苍术与其组培栽培品聚为一类，其中主要药效成分苍术酮、苍术素、茅术醇、β-桉叶醇相对百分含量没有显著差异，苍术酮和苍术素含量明显高于非道地茅苍术。结论研究结果体现了茅苍术药效成分道地性的特征，为茅苍术品质评价提供了依据，组培苗可作为人工补种材料。
【关键词】 茅苍术；组培栽培品；挥发油；气相色谱质谱联用
abstract：objectiveto provide the foundation and scientific base for the wildlife tending and sustainable exploitation of a. lancea (thunb.)dc. through studying the volatile oil of it.methodsthe volatile oil of a. lancea (thunb.)dc. rhizome was determined by gas chromatography and mass spectrometry (gc-ms), and hierarchical clustering ysis was carried out by spss. resultsthe geoherbs and those through tissue culture and cultivated were in the same group. there was no significant difference between them about the active components including atractylon, atractydin, hinesol,β-eudeol and the contents of atractylon and atractydin of this group were higher than those of nongeoherbs obviously. conclusionthe results reflected the characteristics of geoherbs a. lancea (thunb.)dc. and laid the base on the quality evaluation system of them. the seeding through tissue culture can be used as material for additional seeding.
key words：a. lancea (thunb.)dc.; tissue culture and cultivated a. lancea (thunb.)dc.; volatile oil ; gc-ms
茅苍术atractylodes lancea (thunb.) dc.为菊科术属多年生草本植物，其根茎是常用中药苍术的优质高品［1］，为江苏茅山著名的道地药材，具有燥湿健脾、祛风、散寒、明目等功能。WWw.meiword.cOm由于配方用药和原料药需求量的不断增加，再加上近年来山地开垦、过度采挖等多种人为因素及种群自身恢复能力差的影响，野生资源日趋枯竭，已列为江苏省4种濒危药用植物之一［2］。
针对茅苍术野生资源濒危的情况，我们已采用人工辅助授粉、人工补种等方式进行野生抚育研究［3］，并初步建立了茅苍术的快速繁殖系［4，5］，于20xx年开始已先后在句容茅山和宜兴张诸等地进行了茅苍术组培苗的室外移栽工作，取得了初步的成功。本文主要对不同产地茅苍术及组培栽培品挥发油进行气质联用，为茅苍术资源的野生抚育提供基础和科学依据，以促进这一优良种质资源的保存和可持续利用。
1 材料
样品于20xx-11采集于江苏宁镇山脉茅山、灵山和湖北罗田、英山，河南信阳、安徽霍山，组培栽培品采自句容茅山，经南京中医药大学中药资源学教研室巢建国教授鉴定为菊科植物茅苍术a. lancea (thunb.) dc.的干燥根茎。样品来源（编号）见表1。表1 样品来源及编号（略）
2 方法
2.1 供试品溶液的制备 按20xx版《中国药典》挥发油测定甲法提取苍术挥发油，所提挥发油分别用乙醚定容，备用。
2.2 gc-ms条件气质联用仪（gc-ms）为agilent 6890n-5973，谱库为nist98。hp-5ms毛细管色谱柱（0.25 mm×30 m×0.25 μm）；载气为氦气（99.999％）；流速1 ml/min；进样口温度250℃；分流进样，分流比为40∶1；进样量2 μl；柱升温程序：起始40℃，保持5 min，以3℃/min升温至185℃，保持10 min，再以5℃/min升温至250℃，保持5 min。ei离子源，源温230℃，电子能量为70ev，连接器温度280℃，溶剂延迟5 min。扫描范围33～350 amu，电子倍增器电压为2.4 kv。
2.3 数据处理经hp-msd化学工作站检索nist05质谱图并结合有关文献，对流出的色谱峰进行检索，鉴定化合物。利用gc-ms峰面积归一化法计算各组分在茅苍术挥发油中的相对百分含量，使用spss 11.5统计软件进行聚类和卡方检验,并使用“中药色谱指纹图谱相似性计算”软件(由国家药典委员会主持开发，浙江大学等单位承制)进行相似性计算。
3 结果
3.1 主要药效成分比较前人的研究结果表明，茅苍术主要药效成分为苍术酮、苍术素、茅术醇、β-桉叶醇，它们也是体现茅苍术道地性特征的主要成分［1］。我们对这4种成分的相对百分含量进行比较（表2），并以这4种指标成分对不同产地样品进行spss聚类（见图1）。结果表明，组培栽培品与茅山苍术4种成分相对百分含量没有显著差异，与非道地茅苍术存在显著差异，道地茅苍术中苍术酮和苍术素的含量明显高于非道地茅苍术，而非道地茅苍术中β-桉叶醇和茅术醇则高于道地茅苍术。道地产区茅山、灵山苍术与组培栽培品聚为一类。表2 4种主要药效成分比较（略）
3.2 茅苍术挥发油的聚类对气质联用测得的9个样品挥发油总离子流图的图谱数据进行spss聚类，结果见图2。道地产区茅山、灵山苍术与组培栽培品聚为一类，与非道地茅苍术距离较远，表明组培栽培品挥发油与道地茅苍术组成相近，而与其他地区茅苍术的挥发油组成明显不同。这与茅苍术主要药效成分聚类结果相似。
3.3 茅苍术挥发油的相似度将气质联用测得的9个样品挥发油总离子流图的图谱数据导入“中药指纹图谱相似度计算”软件，以1号样品茅山苍术为参照，相似度计算结果见表3。组培栽培品及灵山苍术挥发油与茅山苍术的相似度较高，湖北罗田、英山、河南信阳、安徽霍山茅苍术挥发油与茅山苍术的相似度较低。这与spss聚类结果相符。表3 不同产地茅苍术挥发油的相似度（略）
4 讨论
道地药材的形成从生物学角度来看是基因型和环境之间相互作用的产物［6，7］。基因的适应表达控制蛋白质合成的种类和数量，最终影响与其道地性相关药效成分的形成。由于道地药材具有独特的化学成分，从而形成了其独特的“性味”功能［8］，每种药材所含药效成分的种类及其比例是该种药材特有药理作用的基础。茅山苍术是在长期大量临床实践检验的基础上为历代医家推崇和肯定，其它产地的苍术不具备或达不到医者期望的疗效，显然与其独特的道地性特征有关。前人通过研究揭示了道地茅苍术挥发油组分的特征［1］，我们的研究结果与之相符。
离体快繁是目前在中药材生产中应用最多、最广泛和最有成效的一种技术之一，对珍稀濒危药用植物的资源保护和品种纯化具有十分重要的意义。我们［4，5］已对道地茅苍术进行了细胞组织培养研究，初步建立了茅苍术的快速繁殖系。对茅苍术挥发油的研究结果显示组培栽培品与茅山苍术聚为一类，相似度结果显示两者相似度较高，而与非道地产区有明显的区别，组培栽培品与茅山苍术4种指标成分相对百分含量没有显著差异，也体现了苍术道地性特征。这一结果反映茅苍术的基因组成与种质及生长环境有关。茅苍术组织培养所用外植体取自道地产区，快繁形成的组培苗亦栽种于道地产区，与道地茅苍术的生境相同。研究结果在一定程度上反映利用快速繁殖技术来保护这一濒危药用植物的种质资源是可行的。
人工补种指根据野生药材的繁殖方式，在药材原生地人工栽种，人为增加药材的种群数量，但考虑到野生资源已很稀少，因此选取来源丰富的快繁组培苗为补种材料是一种十分理想的补种方式。以促进这一优良种质资源的保护和可持续利用。
综合我们的研究结果：道地产区茅苍术与其组培栽培品聚为一类，其中主要药效成分苍术酮、茅术醇、β-桉叶醇和苍术素相对百分含量没有显著差异，苍术酮和苍术素含量明显高于非道地茅苍术。茅苍术快繁组培苗可作为人工补种材料，非道地茅苍术不宜作为人工补种材料。研究结果为茅苍术资源的野生抚育及可持续利用提供基础和科学依据。
【参考文献】
［1］欧阳臻,江涛涛,缪亚东,等.苍术的化学成分、道地性和药理活性研究进展［j］.时珍国医国药,20xx,17(10):1936.
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［8］张重义,林文雄,林瑞余.中国道地药材研究现状与展望［j］. 亚热带农业研究,20xx,3(4):258.
文章地址：www.hzydhh.cn/html/322409.html